Dipartimento di Ingegneria Elettrica

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Genetica Molecolare Batterica

Responsabile: Prof. Alessandra Albertini

Collaboratori: Eugenio Ferrari (Visiting Professor)
Elisabetta Andreoli (Tecnica)
Giulia Barbieri (Post Doc)
Stefania Motta (Dottoranda)


Le principali linee di ricerca del gruppo, attivo in particolare nel campo nella Genetica Molecolare e delle Biotecnologie Microbiche, sono due, l’una che riguarda i meccanismi che regolano l’espressione genica in Bacillus subtilis, l’altra rivolta all’uso di batteri come produttori di proteine di varia origine. In particolare E. coli è adatto all’espressione di geni esogeni grazie alle conoscenze del suo metabolismo ed alla vasta collezione di suoi mutanti e vettori.

Regolazione dell'espressione genica nell’organismo modello Bacillus subtilis.
Lo studio della regolazione dell’espressione genica in B. subtilis si è rivolta principalmente ad alcune funzioni geniche attive all’inizio della fase stazionaria ed allo studio di alcuni geni coinvolti nella sintesi de novo del NAD(H) Motilità e produzione del γ-PGA: il gruppo in collaborazione con la Dr. Calvio è interessato alla produzione del polimero poly-gamma-glutamate. Il polimero γ-PGA, in forma libera, o come hydrogel o nanoparticelle da esso derivati con processi chimico-fisici, nel loro insieme stanno stimolando un grande interesse per applicazioni industriali o biomediche, che spaziano dal trattamento di acque reflue di scarto, alla conservazione degli alimenti, al rilascio di farmaci. La sintesi del γ-PGA è stata tradizionalmente attuata da isolati “naturali” di Bacillus sp. Negli ultimo anni diversi gruppi di ricerca nel mondo, che comprendono il il gruppo di Gnetica e Biotecnologie Microbiche del DGM hanno identificato i determinanti genetici che consentono ad un ceppo di laboratorio geneticamente e fisiologicamente più studiato di B. subtilis di mostrare i comportamenti “wild” in particolare per quanto concerne la produzione del polimero.

La sintesi de novo del NAD in Bacillus subtilis: funzioni e regolazione.
L'interesse principale del gruppo è rivolto allo studio dell'espressione di geni coinvolti nella biosintesi del NAD. La regolazione trascrizionale della via biosintetica del NAD è studiata attraverso la creazione di mutanti nel regolatore codificato da yrxA, e la valutazione dei ceppi wt e mutanti del gene pncB/yuek che è difettivo nella via biosintetica di riciclo dell'acido nicotinico. La regolazione post-trascrizionale degli enzimi coinvolti nella sintesi "de novo" è studiata mediante la purificazione e caratterizzazione funzionale ed eventualmente strutturale degli enzimi L-aspartato ossidasi NadB e Chinolato sintasi NadA.
La regolazione dell'espressione dell'operone nrd per la ribonucleotide reduttasi è stata studiata in condizioni di stress ed anaerobiosi in collaborazione con E. Haertig e D. Jahn dell’ Università di Braunschweig - Germania.

“Genome shuffling” ed ingegneria evolutiva in Bacillus.
Scopo finale di questa recente linea di ricerca è quello di ottenere degli ibridi tra diverse specie o ceppi di Bacillus ssp che presentino caratteristiche fenotipiche per crescita e capacità di essere geneticamente manipulate simili a quelle del B. subtilis da un lato e, dall’altro la produttività di quelle correntemente in uso per la produzione di metabolite primary e secondary di interesse industrial.
L’obiettivo di modificare il genotipo dei ceppi batterici verrà raggiunto mediante fusioni tra protoplasti. Recenti pubblicazioni testimoniano infatti che sono state portate a termine con successo fusioni di protoplasti tra microorganismi per selezionare ceppi migliorati che potranno essere utili nella produzione di additivi alimentari, polimeri naturali, flavours, vitamine ed enzimi.

Pubblicazioni sul tema:
1. Nessi C, Albertini AM, Speranza ML and Galizzi A. The outB gene of Bacillus subtilis codes for NAD Synthetase. J. Biol. Chem. 270:6181-6185, 1995
2. Scotti C, Valbuzzi A, Perego M, Galizzi A and Albertini AM. The Bacillus subtilis genes for ribonucleotide reductase are similar to the genes for the second class I NrdE/NrdF enzymes of Enterobacteriaceae. Microbiology, 142: 2995-3004, 1996
3. Kobayashi K, Ehrlich SD, Albertini AM, ...Galizzi A, ...and Ogasawara N. Essential Bacillus subtilis genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(8): 4678-83, 2003
4. Westers H, Dorenbois R, Van Dijl JM, Kabel J, Flanagan T, Devine KM, Jude F, Seror SJ, Beekman AC, Darmon E, Eschevins C, De Jong A, Bron S, Kuipers OP, Albertini AM, Antelmann H, Hecker M, Zamboni N, Sauer U, Bruand C, Ehrlich DS, Alonso JC, Salas M, Quax WJ. Genome Engineering Reveals Large Dispensable Regions in Bacillus subtilis. Mol Biol Evol. 20: 2076-2090, 2003
5. Rossolillo P, Marinoni I, Galli E, Colosimo A, Albertini A M.YrxA is the transcriptional regulator that represses de novo NAD biosynthesis in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 187(20):7155-60, 2005.
6. Härtig E, Hartmann A, Schätzle M, Albertini AM, Jähn D The Bacillus subtilis nrdEF genes, encoding a class Ib Ribonucleotide reducatse, are essential for aerobic and anaerobic growth. Appl. Env. Mic. 72: 5260-5265, 2006
7. Marinoni I, Nonnis S, Monteferrante C, Heathcote P, Härtig E,. Böttger LH, Trautwein AX, Negri A, Albertini AM., Tedeschi G. Characterization of l-aspartate oxidase and quinolinate synthase from Bacillus subtilis. FEBS Journal 275 (20): 5090-5107, 2008

Clonaggio ed iperespressione di nuovi catalizzatori enzimatici.
La conoscenza del corredo genico e quindi enzimatico di di oltre un migliaio di specie batteriche, per le quali è stato determinata la sequenza dell'intero genoma, consente di accedere ad una collezione naturale di attivita` enzimatiche utile nel campo delle biotecnologie farmaceutiche. In particolare ci si interessa al clonaggio di geni per acilasi, enzimi impiegati per la reazione inversa di semi-sintesi di antibiotici Beta-lattamici, da diverse fonti microbiche(Gram+ e Gram-). Inoltre stiamo studiando le caratteristiche di enzimi derivati da clonaggio ed iperespressione in E. coli, dei geni di Bacillus e Lactobacillus coinvolti nella modificazione di basi, puriniche e pirimidiniche e dei nucleosidi di-e tri-fosfati, quali purine e pirimidine fosforilasi, ribonucleotide reduttasi.

Pubblicazioni sul tema:
1. Scaramozzino F, Estruch I, Rossolillo P, Terreni M, Albertini AM. Improvement of catalytic properties of Escherichia coli penicillin G acylase immobilized on glyoxyl agarose by addition of a six-amino-acidtag. Appl Environ Microbiol. 2005, 71(12):8937-40, 20
2. Rocchietti S, Ubiali D, Terreni M, Albertini AM, Fernandez-Lafuente R, Guisan JM, Pregnolato M. Immobilization and stabilization of recombinant multimeric uridine and purine nucleoside phosphorylases from Bacillus subtilis. Biomacromolecules. 2004, 5(6):2195-200.
Ubiali D, Rocchietti S , Scaramozzino F , Terreni M , Albertini A M, Fernández-Lafuente R, Guisán J M, Pregnolato M Synthesis of 2-Deoxynucleosides by transglycosylation with New Immobilized and Stabilized Uridine Phosphorylase and Purine Nucleoside Phosphorylase. Advanced Synthesis & Catalysis. 2004, 346 (11): 1361-1366.
3. Cecchini DA, Serra I, Ubiali D, Terreni M and Albertini AM. New active site oriented glyoxyl-agarose derivatives of Escherichia coli penicillin G acylase. BMC Biotechnol.7: 54, 2007.
4. Serra I, Cecchini DA, Ubiali D, Manazza EM, Albertini AM, Terreni M. Coupling of site-directed mutagenesis and immobilization for the rational design of more efficient biocatalysts. The case of immobilized 3G3K PGA from E. coli. Eur. J. Org. Chem., 9:1384 -1389, 2009
5. Ubiali D., Serra C.D., Serra I., Morelli C.F., Terreni M., Albertini A.M., Manitto P. and Speranza G. Production, characterization and synthetic applicatio of a purine nucleoside phosphorylase from Aereomonas hydrophyla. Adv Synth. Catal. 354, 96-1041, 2012.
6. Serra I., Ubiali D., Cecchini D.A., Calleri E., Albertini A.M., Terreni M., Temporini C.
Assessment of immobilized PGA orientation via the LC-MS analysis of tryptic digests of the wild type and its 3K-PGA mutant assists in the rational design of a high-performance biocatalyst. Anal Bioanal Chem.DOI: 10.1007/s00216-012-6143-z, Jun 19, 2012.



Collaboratori del DBB: Prof. Alessandro Galizzi, Prof. Eugenio Ferrari, Prof. Cinzia Calvio, Dr. Giulia Barbieri, Dr. Viola Scoffone, Dr. Stefania Motta ed Elisabetta Andreoli.
Collaboratori dell'Università di Pavia: Prof. Marco Terreni Prof. Daniela Ubiali, Dr. Immacolata Serra del Dip. Scienze del Farmaco. Prof. Dario Pasini del Dip. Di Chimica.
Enti che Collaborano: Università di Milano, Prof. G. Tedeschi, Prof. A. Negri, Prof. G. Speranza.
Finanziamenti: FAR 2002-2003; FAR 2004-2009; PRINAA 2002/2004; PRINSC 2006-2008 Progetto di Ateneo; Fond. Almamater, Danisco-Genencor, USA; Fondi Dip. Scienze del Farmaco-Reg. Lombardia